РЕЗЮМЕ. Деякі цитозольні ферменти та рекомбінантні білки, гени яких експресуються під контролем метаноліндукованих промоторів, підлягають автофагійній деградації при перенесенні клітин метилотрофних дріжджах Komagataella phaffii з метанолвмісного середовища на середовище з глюкозою. Однак механізм, що лежить в основі специфічної деградації цитозольних білків у дріжджах, залишається недослідженим. З цією метою, у нашій попередній роботі, було розроблено метод селекції мутантів із порушеною деградацією цитозольних білків. Цей метод базувався на використанні штаму K. phaffii, що експресує гібридну βгалактозидазу поєднану з GFP під контролем метаноліндукованого промотора гена FLD1. Активність βгалактозидази можна візуалізувати на чашках Петрі з метанолвмісним середовищем та хромогенним субстратом XGal, що дає можливість ізолювати мутантів з пошкодженою інактивацією цитозольних білків у K. phaffii. У даній роботі для селекції відповідних мутантів було використано NметилN′нітроNнітрозогуанідин. Було отримано колекцію мутанти, які мали синє забарвлення на чашках з багатим глюкозовмісним середовищем з XGal після індукції метанолом. Відібрані мутанти виявляли підвищену активність βгалактозидази та більш інтенсивну флуоресценцію гібридного фермента при перенесенні клітин з метанолу на глюкозу порівняно з вихідним штамом. Питома активність алкогольоксидази, яка бере участь у метаболізмі метанолу, варіювала серед окремих мутантів. Селекціоновані мутанти виявляли дефекти росту за умов азотного голодування та посилене забарвлення флоксином B, що вказує на порушення загальної автофагії.
Ключові слова: βгалактозидаза; NметилN′нітроNнітрозогуанідин; селективна автофагія; Komagatella phaffii
Повний текст та додаткові матеріали
Цитована література
An, G.H., Schuman, D.B., and Johnson, E.A., Isolation of Phaffia rhodozyma mutants with increased astaxanthin content, Appl. Environ. Microbiol., 1989, vol. 55, pp. 116–124. https://doi.org/10.1128/aem.55.1.116-124
Bernauer, L., Radkohl, A., Lehmayer, L.G.K., and Emmerstorfer-Augustin, A., Komagataella phaffii as emerging model organism in fundamental research, Front. Microbiol., 2021, vol. 11, p. 607028. https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.607028
Choi, A.M., Ryter, S.W., and Levine, B., Autophagy in human health and disease, N. Engl. J. Med., 2013, vol. 368, pp. 651–662. https://doi.org/10.1056/NEJMra1205406
Dmytruk, O., Bulbotka, N., and Sibirny, A., Degradation of Methanol Catabolism Enzymes of Formaldehyde Dehydrogenase and Formate Dehydrogenase in Methylotrophic Yeast Komagataella phaffii, Cytol. Genet., 2020, vol. 54, pp. 393–397. https://doi.org/10.3103/S0095452720050047
Dmytruk, O., Bulbotka N., Zazulya A., Semkiv M., Dmytruk K., and Sibirny A., Fructose-1,6-bisphosphatase degradation in the methylotrophic yeast Komagataella phaffii occurs in autophagy pathway, Cell Biol. Int., 2021, vol. 45, pp. 528–535. https://doi.org/10.1002/cbin.11304
Farré, J.C., Manjithaya, R., Mathewson, R.D., and Subramani, S., Pp Atg30 tags peroxisomes for turnover by selective autophagy, Dev. Cell, 2008, vol. 14, pp. 365–376. https://doi.org/10.1016/j.devcel.2007.12.011
Geng, J. and Klionsky, D.J., The Atg8 and Atg12 ubiquitin-like conjugation systems in macroautophagy Protein modifications: beyond the usual suspects’ review series, EMBO Rep., 2008, vol. 9, pp. 859–864. https://doi.org/10.1038/embor.2008
Gleeson, M.A., White, C.E., Meininger, D.P., and Komives, E.A., Generation of protease-deficient strains and their use in heterologous protein expression, Methods Mol. Biol., 1998, vol. 103, pp. 81–94. https://doi.org/10.1385/0-89603-421-6:81
Heistinger, L., Gasser, B., and Mattanovich, D., Microbe profile: Komagataella phaffii: a methanol devouring biotech yeast formerly known as Pichia pastoris, Microbiology, 2020, vol. 166, pp. 614–616. https://doi.org/10.1099/mic.0.000958
Kirkin, V. and Rogov, V.V., A diversity of selective autophagy receptors determines the specificity of the autophagy pathway, Mol. Cell, 2019, vol. 76, pp. 268–285. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2019.09.005
Kirkin, V., McEwan, D.G., Novak, I., and Dikic, I., A role for ubiquitin in selective autophagy, Mol. Cell, 2009, vol. 34, pp. 259–269. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2009.04.026
Klionsky, D.J., Cregg, J.M., Dunn, W.A., Emr, S.D., Sakai, Y., Sandoval, I.V., Sibirny, A.A., Subramani, S., Thumm, M., Veenhuis, M., and Ohsumi, Y., A unified nomenclature for yeast autophagy-related genes, Dev. Cell, 2003, vol. 5, pp. 539–545. https://doi.org/10.1016/s1534-5807(03)00296-x
Lowry, O., Rosebrough, N., Farr, A., and Randall, R., Protein measurement with the Folin phenol reagent, J. Biol. Chem., 1951, vol. 193, pp. 265–275.
Manjithaya, R., Nazarko, T.Y., Farré, J.C., and Subramani, S., Molecular mechanism and physiological role of pexophagy, FEBS Lett., 2010, vol. 584, pp. 1367–1373. https://doi.org/10.1016/j.febslet.2010.01.019
Mastropietro, G., Aw, R., and Polizzi, K.M., Expression of proteins in Pichia pastoris, Methods Enzymol., 2021, vol. 660, pp. 53–80. https://doi.org/10.1016/bs.mie.2021.07.004
Mizushima, N. and Komatsu, M., Autophagy: renovation of cells and tissues, Cell, 2011, vol. 147, pp. 728–741. https://doi.org/10.1016/j.cell.2011.10.026
Mizushima, N., Yoshimori, T., and Ohsumi, Y., The role of Atg proteins in autophagosome formation, Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 2011, vol. 27, pp. 107–132. https://doi.org/10.1146/annurev-cellbio-092910-154005
Noda, T., Viability assays to monitor yeast autophagy, Methods Enzymol., 2008, vol. 451, pp. 27–32. https://doi.org/10.1016/S0076-6879(08)03202-3
Onodera, J. and Ohsumi, Y., Autophagy is required for maintenance of amino acid levels and protein synthesis under nitrogen starvation, J. Biol. Chem., 2005, vol. 280, pp. 31582–31586. https://doi.org/10.1074/jbc.M506736200
Pohl, C. and Dikic, I., Cellular quality control by the ubiquitin-proteasome system and autophagy, Science, 2019, vol. 366, pp. 818–822. https://doi.org/10.1126/science.aax3769
Polupanov, A.S. and Sibirny, A.A., Cytoplasmic extension peptide of Pichia pastoris glucose sensor Gss1 is not compulsory for glucose signaling, Cell Biol. Int., 2014, vol. 38, pp. 172–178. https://doi.org/10.1002/cbin.10189
Sibirny, A.A., Mechanisms of autophagy and pexophagy in yeasts, Biochemistry, 2011, vol. 76, pp. 1279–1290. https://doi.org/10.1134/S0006297911120017
Sibirny, A.A., Yeast peroxisomes: structure, functions and biotechnological opportunities, FEMS Yeast Res., 2016, vol. 16, pp. 3–4. https://doi.org/10.1093/femsyr/fow038
Tsukada, M. and Ohsumi, Y., Isolation and characterization of autophagy-defective mutants of Saccharomyces cerevisiae, FEBS Lett, 1993, vol. 333, pp. 169–174. https://doi.org/10.1016/0014-5793(93)80398-e
Waterham, H.R., de Vries, Y., Russel, K.A., Xie, W., Veenhuis, M., and Cregg, J.M., The Pichia pastoris PER6 gene product is a peroxisomal integral membrane protein essential for peroxisome biogenesis and has sequence similarity to the Zellweger syndrome protein PAF-1, Mol. Cell Biol., 1996, vol. 16, pp. 2527–2536. https://doi.org/10.1128/MCB.16.5.2527
Zazulya, A.Z., Semkiv, M.V., Stec, M., Cyske, Z., Gaffke, L., Pierzynowska, K., Węgrzyn, G., and Sibirny, A.A., The Komagataella phaffii ACG1 gene, encoding β-1,6-N-acetylglucosaminyltransferase, is involved in the autophagy of cytosolic and peroxisomal proteins, Yeast, 2023, vol. 40, pp. 367–376. https://doi.org/10.1002/yea.3846