Загальний вміст РНК в ооцитах овець та ембріонах, отриманих in vitro: порівняльне дослідження спектрофотометричного та флуорометричного методів
РЕЗЮМЕ. Виділення загального вмісту РНК з обмеженої кількості ооцитів та ембріонів – це дуже складне завдання. Виділення тотальної РНК без домішок ДНК та оцінка цілісності РНК надзвичайно важливі для успішності досліджень експресії генів, оскільки використання РНК низької якості може призвести до отримання некоректних результатів. Мета даного дослідження полягала у встановленні належного протоколу виділення тотальної РНК хорошої якості з мінімальної кількості ооцитів овець та ембріонів для прикладних програм, а також в оцінці вмісту РНК в ооцитах та на певних стадіях розвитку ембріонів. Для виділення тотальної РНК з ооцитів та ембріонів було використано п’ять протоколів. Чотири методи передбачали використання тризолу згідно з стандартним протоколом та його модифікацією, а для п’ятого методу використовували комерційний набір (міні-набір RNeasy, Quiagen). Тотальна РНК, виділена згідно з модифікованим протоколом використання тризолу зі співосаджувачами (акриламідом та глікогеном), показала значно вищі (P < 0.05) спектрофотометричні показники концентрації РНК, ніж результати методу, що передбачав використання модифікованого протоколу без співосаджувача з наступним застосуванням комерційного набору та звичного протоколу використання тризолу. Якість, чистота та концентрація РНК, кількість РНК на один ооцит та експресія ГАФДГ (ген «домашнього господарства») порівнювали для виявлення найкращої РНК серед виділених за різними протоколами. Спектрофотометричний та флюорометричний методи порівнювали для кількісного визначення концентрації тотальної РНК в ооцитах овець та на різних стадіях розвитку ембріонів. Вихід РНК за спектрофотометричним методом показав у 5–100 разів вищі результати порівняно з флуорометричним методом. Значне зниження вмісту РНК (P < 0.05) спостерігалось у зрілих ооцитах порівняно з незрілими ооцитами. Значне підвищення (P < 0.05) вмісту РНК було зазначено після фертилізації до стадії 2–4 клітин, після чого відбувалось значне зниження (P < 0.05) на стадії 8–16 клітин з наступним підвищенням на стадії морули. Концентрація РНК у бластоциті була значно нижчою, ніж у морулі. З-поміж використаних протоколів, використаних для виділення РНК з декількох ооцитів овець та ембріонів для дослідження експресії генів, найбільш ефективним та придатним виявився модифікований протокол застосування тризолу з співосаджувачем.
Ключові слова: RNA, oocytes, embryos, sheep, spectropho-tometer, fluorometer