ISSN 0564-3783  



Головна
Контакти
Архів  
Тематика журналу
Підписка
До уваги авторів
Редколегія
Мобільна версія


In English

Export citations
UNIMARC
BibTeX
RIS





Получение трансгенных растений картофеля, экспрессирующих ген лактоферрина человека, и анализ их устойчивости к фитопатогенам

Бузиашвили А., Чередниченко Л., Кропивко С., Блюм Я.Б., Емец А.

Оригінальна работа 




С помощью Agrobacterium-опосредованной трансформации осуществлен перенос гена лактоферрина человека (hLf) в геном ряда сортов картофеля (Solanum tuberosum) украинской селекции (Вернисаж, Левада, Свитанок Киевский и Зарево). Для этого использовали плазмидный вектор pBIN35LF, несущий ген hLf под контролем 35S промотора вируса мозаики цветной капусты и терминатора октопинсинтазы, а также селективный маркерный ген неомицинфосфотрансферазы ІІ (nptII), обеспечивающий устойчивость к канамицину. В результате селекции были отобраны 44 линии сорта Вернисаж, 26 линий сорта Левада, 25 линий сорта Свитанок Киевский и 16 линий сорта Зарево, устойчивых к 100 мг/л канамицину. Интеграция целевого гена в геном картофеля была подтверждена с помощью полимеразной цепной реакции с использованием специфических праймеров к гену hLf. Идентификацию рекомбинатного лактоферрина в тканях трансгенных линий проводили с помощью Вестерн блоттинга с использованием специфических моноклональных антител к лактоферрину. Отобранные трансгенные линии картофеля были протестированы на устойчивость к бактериальным и грибному фитопатогенам. С помощью теста диффузии в агар установлено, что сок трансгенных линий картофеля обладает антибактериальным эффектом по отношению к таким фитопатогенным бактериям, как Ralstonia solanacearum (возбудитель бактериальной гнили картофеля) и Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (возбудитель кольцевой гнили картофеля). Устойчивость трансгенных растений картофеля к фитофторозу изучали путем заражения растений in vitro изолятом Phytophthora infestans. В результате была установлена повышенная устойчивость полученных трансгенных линий картофеля к P. infestans по сравнению с контролем. Таким образом, полученные данные показывают, что перенос гена hLf гена в геном картофеля повышает его устойчивость к бактериальным и грибным патогенам.

РЕЗЮМЕ. За використання Agrobacterium-опосередкованої  трансформації було здійснено перенесення  гена лактоферина людини в геном ряда сортів картоплі (Solanum tuberosum) української селекції (Вернісаж, Левада, Світанок Київський та Зарево). Для цього використовували плазмідний вектор pBIN35LF, який ніс ген лактоферина людини hLf під контролем 35S промотора віруса мозаїки цвітної капусти та термінатора октопінсинтази, а також селективний маркерний ген неоміцинфосфотрансферази ІІ (nptII), що забезпечує стійкість до канаміцина. В результаті селекції були відібрані 44 лінії сорта Вернісаж, 26 ліній сорта Левада, 25 ліній сорта Світанок Київський та 16 ліній сорта Зарево, стійких до 100 мг/л канаміцина. Інтеграція цільового гена в геном картоплі була підтверджена за допомогою метода полімеразної ланцюгової реакції за використання специфічних праймерів до гена hLf. Ідентифікацію рекомбінатного лактоферина в тканинах трансгенних ліній проводили за допомогою Вестерн блоттинга за використання специфічних моноклональних антитіл до лактоферину. Відібрані трансгенні лінії картоплі були протестовані на стійкість до бактеріальних та грибних фітопатогенів. За допомогою теста дифузії в агар було встановлено, що сік трансгенних ліній картоплі володіє антибактеріальним ефектом по відношенню до таких фітопатогенних бактерій, як  Ralstonia solanacearum (збудник бактеріальної гнилі картоплі) та Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (збудник кільцевої гнилі картоплі). Стійкість трансгенних ліній картоплі до фітофтороза досліджували шляхом зараження рослин in vitro ізолятом Phytophthora infestans. В результаті була встановлена підвищена стійкість отриманих трансгенних ліній картоплі до P. infestans у порівнянні з контролем. Таким чином, отримані дані вказують на те, що перенос гена hLf в геном картоплі підвищує її стійкість до бактеріальних та грибних патогенів. 

Ключові слова: ген лактоферину людини, генетична трансформація, Solanum tuberosum, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, Ralstonia solanacearum, Phytophthora infestans
ген лактоферрина человека, генетическая трансформация, Solanum tuberosum, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, Ralstonia solanacearum, Phytophthora infestans

Цитологія і генетика 2020, том 54, № 3, C. 3-15

  1. Институт пищевой биотехнологии и геномики Национальной академии наук Украины, Украина, 04123, Киев, ул. Осиповского 2,a
  2. Институт картофелеводства Национальной академии аграрных наук Украины, Украина, 07853, Киевская область, Немешаево, ул. Чкалова 22
  3. Институт молекулярной биологии и генетики Национальной академии наук Украины Украина, 03860, Киев, ул. акад. Заболотного 150

E-mail: buziashvili.an gmail.com, yemets.alla gmail.com

Бузиашвили А., Чередниченко Л., Кропивко С., Блюм Я.Б., Емец А. Получение трансгенных растений картофеля, экспрессирующих ген лактоферрина человека, и анализ их устойчивости к фитопатогенам, Цитологія і генетика., 2020, том 54, № 3, C. 3-15.

В "Cytology and Genetics". Якщо тільки можливо, цитуйте статтю по нашій англомовній версії:
A. Buziashvili, L. Cherednichenko, S. Kropyvko, Ya. B. Blume & A. Yemets Obtaining Transgenic Potato Plants Expressing the Human Lactoferrin Gene and Analysis of Their Resistance to Phytopathogens, Cytol Genet., 2020, vol. 54, no. 3, pp. 179–188
DOI: 10.3103/S0095452720030020


Посилання

1. Melnyk, S.I., Kovchi, A.L., Stefkivska, Y.L., Kravchuk, O.O., and Gorytska, T.V., Potato market in Ukraine, Plant Var. Stud. Protect., 2017, vol. 13, no. 2, pp. 206–210. https://doi.org/10.21498/2518-1017.13.2.2017.105419

2. Cook, E., Agriculture, Forestry and Fishery Statistics, Luxembourg: Publications Office of the European Union, 2018.

3. Kolobayev, V.A. and Rogozina, Ye.V., Cultivars immunity to phytopathogens as a factor of environmental safety: the cases of potato and sugarcane, Biosphere, 2014, vol. 6, no. 3, pp. 222–230.

4. Erenkova, L.A., Molyavko, A.A., Marukhlenko, A.V., and Borisova, N.P., New generation potato varieties with resistance to pathogens, Breeding, Seed Product.Genet., 2018, vol. 4, pp. 47–50. https://doi.org/10.24411/2413-4112-2018-10007

5. Fiers, M., Edel-Hermann, V., Chatot, C., Alabouvette, C., and Steinberg, C., Potato soil-borne diseases. A review, Agron. Sustainable Dev., 2012, vol. 32, pp. 93–132. https://doi.org/10.1007/s13593-011-0035-z

6. Gordienko, V.V. and Zaharchuk, N.A., Creation of initial breeding material of potato with complex resistance to Fusarium dry rot and tuber late blight, Plant Varieties Stud. Protect., 2017, vol. 13, no. 3, pp. 239–244.https://doi.org/10.21498/2518-1017.13.3.2017

7. Kolomiets, Y.V., Grygoryuk, I.P., and Butsenko, L.M., Bacterial diseases of tomato plants in terms of open and covered growing of Ukraine, Ann. Agrar. Sci., 2017, vol. 15, no. 2, pp. 213–216. https://doi.org/10.1016/j.aasci.2017.05.010

8. Kolomiets, Y.V., Grygoryuk, I.P., Butsenko, L.M., and Kalinichenko, A.V., Biotechnological control methods against phytopathogenic bacteria in tomatoes, Appl. Ecol. Environ. Res., 2019, vol. 17, no. 2, pp. 3215– 3230. https://doi.org/10.15666/aeer/1702_32153230

9. Kolomiets, Y.V., Grygoryuk, I.P., Likhanov A., But-senko L.M., and Blume Ya., Induction of bacterial canker resistance in tomato plants using plant growth promoting Rhizobacteria, Open Agric. J., 2019, vol. 13, pp. 215–22.https://doi.org/10.2174/18743315019

10. Boroday, V.V. and Parfeniuk, A.I., Spreading and development of the main potato (Solanum tuberosum L.) diseases in Ukraine, Agroecol. J., 2018, vol. 4, pp. 82–87. https://doi.org/10.33730/2077-4893.4.2018.161774

11. Lopez-Garcia, B., San Segundo, B., and Coca, M., Antimicrobial peptides as a promising alternative for plant disease protection, in Small Wonders:Peptides for Disease Control, 2012, pp. 263–294. https://doi.org/10.1021/bk-2012-1095.ch013

12. Moosa, A., Farzand, A., Sahi, S.T., and Khan, S.A., Transgenic expression of antifungal pathogenesis-related proteins against phytopathogenic fungi—15 years of success, Israel. J. Plant Sci., 2017. doi 80/07929978.2017.1288407

13. Jung, Y., Kang, K., Application of antimicrobial peptides for disease control in plants, Plant Breed. Biotechnol., 2014, vol. 2, no. 1, pp. 1–13. https://doi.org/10.9787/PBB.2014.2.1.001

14. Patil, V.U., Gopal, J., and Singh, B.P., Improvement for bacterial wilt resistance in potato by conventional and biotechnological approaches, Agric. Res., 2012, vol. 1, pp. 299–316. https://doi.org/10.1007/S40003-012-0034-6

15. Yemets, A.I., Tanasienko, I.V., Krasylenko, Y.A., and Blume, Y.B., Plant-based biopharming of recombinant human lactoferrin, Cell Biol. Int., 2014, vol. 38, pp. 989–1002. https://doi.org/10.1002/cbin.10304

16. Murashige, T. and Skoog, F., A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures, Physiol. Plant.,1962, vol. 15, pp. 473–497. https://doi.org/10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x

17. Buziashvili, A. and Yemets, A., Obtaining of tomato and potato plants with human lactoferrin gene hLf, Rep. Natl. Acad. Sci. Ukr., 2018, vol. 10, pp. 88–94. https://doi.org/10.15407/dopovidi2018.10.088

18. Sambrook, J.F. and Russell, D.W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 2001.

19. Jeroen, S., Damm, B., Melchers, L., and Hoekema, A., Factors influencing transformation frequency of tomato (Lycopersicon esculentum), Plant Cell Rep., 1993, vol. 12, pp. 644–647. https://doi.org/10.1007/BF00232816

20. Rogers, S.O., Bendich, A.J., Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues, Plant Mol. Biol., 1985, vol. 5, pp. 69–76. https://doi.org/10.1007/BF00020088

21. Tanasienko, I.V., Yemets, A.I., Pirko, Y.V., Korhkovyy, V.I., Abumhadi, N., and Blume, Y.B., Generation of transgenic barley lines producing human lactoferrin using mutant alpha-tubulin gene as the selective marker, Cytol. Genet., 2011, vol. 45, no. 1, pp. 3–10. https://doi.org/10.3103/S0095452711010026

22. Baskaran, P., Soys, V., Balazs, E., and Van Stadena, J., Shoot apical meristem injection: A novel and efficient method to obtain transformed cucumber plants, S. Afr. J. Bot., 2016, vol. 103, pp. 210–215. https://doi.org/10.1016/j.sajb.2015.09.006

23. Mitra, A., Zhang, Z., Expression of a human lactoferrin cDNA in tobacco cells produces antibacterial protein(s), Plant Physiol., 1994, vol. 106, no. 3, pp. 977–981.

24. Rachmawati, D., Mori, T., Hosaka, T., Takaiwa, F., Inoue, E., and Anzai, H., Production and characterization of recombinant human lactoferrin in transgenic Javanica rice, Breed. Sci., 2005, vol. 55, no. 2, pp. 213–222. https://doi.org/10.1270/jsbbs.55.213

25. Bradford, M., A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem., 1976, vol. 72, no. 1–2, pp. 248–254.

26. Laemmli, U., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 1970, vol. 227, pp. 680–5.

27. Onuoha, S.C., Alisa, C.O., Antimicrobial potential of leaf juice and extracts of Moringa oleifera lam against some human pathogenic bacteria, J. Pharm. Biol. Sci., 2013, vol. 5, no. 4, pp. 37–42. https://doi.org/10.9790/3008-0543742

28. Chahardooli, M., Farzaneh, A., and Sohrabi, A., Expression of recombinant Arabian camel lactofer-ricin-related peptide in Pichia pastoris and its antimicrobial identification, J. Sci. Food Agricult., 2016, vol. 96, no. 2, pp. 569–575. https://doi.org/10.1002/jsfa.7125

29. Yabuuchi, E., Kosako, Y., Oyaizu, H., Yano, I., Hotta, H., Hashimoto, Y., Ezaki, T., and Arakawa, M., Proposal of Burkholderia gen. nov. and transfer of seven species of the genus Pseudomonas homology group II to the new genus, with the type species Burkholderia cepacia (Palleroni and Holmes 1981) comb. nov., Microbiol. Immunol., 1992, vol. 36, no. 12, pp. 1251–75. https://doi.org/10.1111/j.1348-0421.1992.tb02129.x

30. Podgorskiy, V.S., Ukrainian National Collection of Microorganisms, 2nd ed., Kyiv: Naukova Dumka, 2007.

31. Tournas, V., Stack, M.E., Mislivec, P.B., Koch, H.A., and Bandler, R., FDA Bacteriological Analytical Manual, chapter 18: Yeasts, Molds, and Mycotoxins, 8th ed., Revision A, USA: AOAC International, 1998.

32. Tkachyk, S.O., Methods of Phytopathological Researches with Artificial Infection of Plants, Kyiv: Nylan-LTD, 2014.

33. Cherednichenko, L.M., Evaluation of the potato selection material for the resistance of the aboveground plant parts to late blight with the use of detached leaf particles, Potato Grow. Ukr., 2013, vols. 1–2, pp. 19–24.

34. Podhaietskyi, A.A., Kravchenko, N.V., Kovalenko, V.M., Bondus, R.O., Hordienko, V.V., Cherednichenko, L.M., and Sobra, V.M., Ecological testing of potatoes, Ukr. J. Ecol., 2018, vol. 8, no. 4, pp. 17–25.

35. Michalska, A.M., Sobkowiak, S., Flis, B. Zimnoch-Guzowska, E., Virulence and aggressiveness of Phytophthora infestans isolates collected in Poland from potato and tomato plants identified no strong specificity, Eur. J. Plant Pathol., 2016, vol. 144, pp. 325–336. https://doi.org/10.1007/s10658-015-0769-6

36. Buziashvili A.Yu. and Yemets, A.I., Agrobacterium-mediated transformation of potato with human lactoferrin gene, Fact. Exp. Evol. Org., 2019, vol. 25, pp. 184–189.

37. Han, E.H., Goo, Y.M., Lee, M.K., and Lee, S.W., An efficient transformation method for a potato (Solanum tuberosum L. var. Atlantic), J. Plant Biotechnol., 2015, vol. 42, pp. 77–82. https://doi.org/10.5010/JPB.2015.42.2.77

38. Shin, D.Y., Seong, E.S., Na, J.K., Yoo, J.H., Kang, W.H., Ghimire, B.K., Lim, J.D., Yu, C.Y., Conditions for regeneration and transformation of Solanum tuberosum cultivars using the cotton glutathione S-transferase (Gh-5) gene, Afr. J. Biotechnol., 2011, vol. 10, no. 67, pp. 15135–15141. https://doi.org/10.5897/AJB11.1895

39. Soto, N., Enriquez, G.A., Ferreira, A., Corrada, M., Fuentes, A., Tiel, K., and Pujol, M., Efficient transformation of potato stems segments from cultivar Desiree, using phosphinothricin as selection marker, Biotechnol. Apl., 2007, vol. 24, no. 2, pp. 139–144.

40. Craze, M., Bates, R., Bowden, S., and Wallington, E.J., Highly efficient Agrobacterium-mediated transformation of potato (Solanum tuberosum) and production of transgenic microtubers, Curr. Protoc. Plant Biol., 2018, vol. 3, no. 1, pp. 33–41. doi 10.1002/cppb.20065

41. Alimohammadi, M., Bagherieh-Najjar, M., Agrobacterium-mediated transformation of plants: basic principles and influencing factors, Afr. J. Biotechnol., 2009, vol. 8, no. 20, pp. 5142–5148.

42. Opabode, J., Agrobacterium-mediated transformation of plants: emerging factors that influence efficiency, Biotechnol. Mol. Biol. Rev., 2006, vol. 1, no. 1, pp. 12–20.

43. Bakhsh, A., Anayol, E., and Ozcan, S., Comparison of transformation efficiency of five Agrobacterium tumefaciens strains in Nicotiana tabacum L., Emirates J. Food Agricult., 2014, vol. 26, no. 3, pp. 259–264. https://doi.org/10.9755/ejfa.v26i3.16437

44. Gelvin, S., Liu, C., Genetic manipulation of Agrobac-terium tumefaciens strains to improve transformation of recalcitrant plant species, Plant Mol. Biol. Manual., 1994, pp. 85–97.

45. Stefanova, G., Slavov, S., Gecheff, K., Vlahova, M., and Atanassov, A., Expression of recombinant human lactoferrin in transgenic alfalfa plants, Biol. Plant., 2013, vol. 57, no. 3, pp. 457–464.

46. Vlahova, M., Stefanova, G., Petkov, P., Barbulova, A., Petkova, D., Kalushkov, P., and Atanassov, A., Genetic modification of alfalfa (Medicago sativa L.) for quality improvement and production of novel compounds, Biotechnol. Biotechn. Equipm., 2005, vol. 19, no. 3, pp. 56–62. doi 0/13102818.2005.10817286

47. Legrand, D., Salmon, V., Spik, G., Gruber, V., Bournat, P., and Merot, B., Recombinant lactoferrin, methods of production from plants and uses, US Patent No. 6569831 B1, May 27, 2003.

48. Chong, D.K., Langridge, W.H., Expression of full-length bioactive antimicrobial human lactoferrin in potato plants, Transgen. Res., 2000, vol. 9, no. 1, pp. 71–78. https://doi.org/10.1023/A:1008977630179

49. On the Amendments to the List of Regulated Pests, The edition of the order of the Ministry of Agrarian Policy and Food of Ukraine, July 16, 2019.

50. Fukuta, S., Kawamoto, K., Mizukami, Y., Yoshimura, Y., Ueda, J., and Kanbe, M., Transgenic tobacco plants expressing antimicrobial peptide bovine lactoferricin show enhanced resistance to phyto-pathogens. Plant Biotechnol., 2012, vol. 29, no. 4, pp. 383–389. https://doi.org/10.5511/plantbiotechnology.12.0619a

51. Sohrabi, S.M., Niazi, A., Chahardooli, M., and Aram, F., Isolation and expression of antimicrobial camel lactoferrin (cLf) gene in tobacco, Plant OMICS, 2014, vol. 7, pp. 298–307.

52. Chahardooli, M., Fazeli, A., Niazi, A., and Ghabooli, M., Recombinant expression of LFchimera antimicrobial peptide in a plant-based expression system and its antimicrobial activity against clinical and phytopathogenic bacteria, Biotechnol. Biotechn. Equipm., 2018, vol. 32, no 3, pp. 714–723. https://doi.org/10.1080/13102818.2018.1451780

53. Humphrey, B.D., Huang, N., and Klasing, K.C., Rice expressing lactoferrin and lysozyme has antibiotic-like properties when fed to chicks, J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr., 2003, vol. 36, no. 2, pp. 190–199. https://doi.org/10.1093/jn/132.6.1214

54. Lee, T.T., Chang, C.C., Juang, R.S., Chen, R.B., Yang, H.Y., Chu, L.W., Wang, S.R., Tseng, T.H., Wang, C.S., Chen, L.J., and Bi, Yu., Porcine lactoferrin expression in transgenic rice and its effects as a feed additive on early weaned piglets, J. Agric. Food Chem., 2010, vol. 58, no. 8, pp. 5166–5173. https://doi.org/10.1021/jf903904s

55. Takase, K., Hagiwara, K., Onodera, H., Nishizawa, Y., Ugaki, M., Omura, T., Numata, S., Akutsu, K., Kumura, H., and Shimazaki, K., Constitutive expression of human lactoferrin and its N-lobe in rice plants to confer disease resistance, Biochem. Cell Biol., 2005, vol. 83, no. 2, pp. 239–49. https://doi.org/10.1139/o05-022

56. Franco, I., Castillo, E., Perez, M.D., Calvo, M., and Sanchez, L., Effects of hydrostatic high pressure on the structure and antibacterial activity of recombinant human lactoferrin from transgenic rice, Biosci. Biotechnol. Biochem., 2012, vol. 76, no. 1, pp. 53–59. https://doi.org/10.1271/bbb.110433

57. Funakoshi, T., Hosaka, T., Inoue, E., and Anzai, H., Gene expression of lactoferrin-derived antimicrobial peptides in rice, Plant Physiol. Biochem., 2017, vol. 123. https://doi.org/10.1016/j.plaphy.2017.12.037

58. Lee, T. J., Coyne, D. P., Clemente, T. E., and Mitra, A., Partial resistance to bacterial wilt in transgenic tomato plants expressing antibacterial lactoferrin gene, J. Am. Soc. Horticult. Sci., 2002, vol. 127, no. 2, pp. 158–164. https://doi.org/10.21273/JASHS.127.2.158

59. Jo, S.H., Kwon, S.Y., Park, D.S., Yang, K.S., Kim, J.W., Lee, K.T., Kwak, S.S., and Lee, H.S., High-yield production of functional human lactoferrin in transgenic cell cultures of Siberian ginseng (Acanthopanax senticosus), Biotechnol. Bioprocess Eng., 2006, vol. 11, no. 5, pp. 442–448. https://doi.org/10.1007/BF02932312

60. Malnoy, M., Venisse, J.S., Brisset, M.N., and Chevreau, E., Expression of bovine lactoferrin cDNA confers resistance to Erwinia amylovora in transgenic pear, Mol. Breed., 2003, vol. 12, no. 3, pp. 231–244. https://doi.org/10.1023/A:1026365311067

61. Nguyen, T.C., Lakshman, D.K., Han, J., Galvez, L.C., and Mitra, A., Transgenic plants expressing antimicrobial lactoferrin protein are resistant to a fungal pathogen, J. Plant Mol. Biol. Biotechnol., 2011, vol. 2, no.1, pp. 1–8.

62. Han, J., Lakshman, D.K., Galvez, L.C., Mitra, S., Baenziger, P.S., and Mitra, A., Transgenic expression of lactoferrin impacts enhanced resistance to head blight of wheat caused by Fusarium graminearum, BMC Plant Biol., 2012, vol. 12, no. 33. https://doi.org/10.1186/1471-2229-12-33

63. Bruni, N., Capucchio, M.T., Biasibetti, E., Pessione, E., Cirrincione, S., Giraudo, L., Corona, A., and Dosio, F., Antimicrobial activity of lactoferrin-related peptides and applications in human and veterinary medicine, Molecules, 2016, vol. 21, no. 6. https://doi.org/10.3390/molecules21060752

64. Fernandes, K.E., Carter, D.A., The antifungal activity of lactoferrin and its derived peptides: mechanisms of action and synergy with drugs against fungal pathogens, Front. Microbiol., 2017, vol. 8, no. 2. https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.00002

65. Fry, W., Phytophthora infestans: the plant (and R gene) destroyer, Mol. Plant Pathol., 2008, vol. 9, no. 3, pp. 385–402.https://doi.org/10.1111/j.1364-3703.2007

66. Dominguez, P., Gomez, I., Barbero, M., Fellmann, T., Chatzopoulos, T., Jensen, H., and Philippidis, G., Eu Commodity Market Development: Medium-Term Agricultural Outlook, Luxembourg: Publ. Office. Eur. Union, 2018, ISBN 978-92-79-97850-0, https://doi.org/10.2760/4519, JRC113987

Copyright© ICBGE 2002-2021 Coded & Designed by Volodymyr Duplij Modified 29.11.21