ISSN 0564-3783  



Головна
Контакти
Архів  
Тематика журналу
Підписка
До уваги авторів
Редколегія
Мобільна версія


In English

Export citations
UNIMARC
BibTeX
RIS





Consistent Production of Mice With Conditional Knockout Alleles by CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing Using Two Guides/Two Oligos Approach

GOLOVKO ANDREI, ADAMS JOHN, GUO HUIPING, BALLARD JOHNATHAN, GONZALES AMY, MORPURGO BEN

Реферат статті 




РЕЗЮМЕ. Целенаправленное изменение геномной ДНК широко используется для создания мышей-мутантов и для изучения функций генов in vivo. Мыши-нокауты, способные передавать инактивированный аллель своему потомству, являются ценными генетическими моделями наследственных заболеваний и часто демонстрируют эмбриональную или раннюю постнатальную летальность. Для изучения функции генов у взрослых мышей и у отдельных типов клеток была разработана усовершенствованная стратегия условной инактивации генов, основанная на ДНК-рекомбиназе Cre и ее сайтах узнавания (loxP). Этот подход традиционно основывался на многоступенчатом и трудоемком процессе, включающем редактирование генома в эмбриональных стволовых (ES) клетках и использовании их для получения химер. Кроме того, этот процесс имеет некотрые ограничения, такие как необходимые особенности структуры встраиваемой кассеты вектора ДНК, часто неправильное редактирование и трудности наследования линии модифицированного аллеля от химерных мышей. Технология редактирования генов CRISPR-Cas9 значительно упростила получение нокаутных аллелей мышей, избавив от многих громоздких и трудоемких этапов традиционного подхода с использованием мышиных ES клеток. Тем не менее, генерация условных нокаутных аллелей (conditional knockouts) остается важной задачей. В более раннем исследовании сообщалось о почти 16 % эффективности генерации аллелей условного нокаута у мышей с использованием так называемого метода 2-g 2-o (2-х цельных РНК-гидов (sgRNA) и 2-х одноцепочечных олигонуклеотидов (ssODN)) , что было поставлено под сомнение другой группой авторов, проанализировавшей результаты полученные несколькими трансгенными лабораториями. Используя CRISPR / Cas9 в качестве инструмента модификации генома мыши, мы оценили эффективность использования этого метода в создании условных нокаутных аллелей в трех генах: фосфатаза и регулятор актина 1 (Phactr1), аполипопротеин A1 (ApoA1) и связанный с актином протеин Т2 (Actrt2). Несмотря на то, что общая эффективность метода оказалась низкой - около 2,5% - мы показали, что можно с высокой долей вероятности генерировать аллели условных нокаутов мышей с использованием CRISPR / Cas9 на постоянной основе.

Ключові слова: изменение геномной ДНК, услов­ные нокауты мышей, CRISPR/Cas9, цельные РНК­гиды

Цитологія і генетика 2020, том 54, № 1, C. 80-81

  • Texas A&M Institute for Genomic Medicine, College Station, TX 77843

E-mail: agolovko tigm.org

GOLOVKO ANDREI, ADAMS JOHN, GUO HUIPING, BALLARD JOHNATHAN, GONZALES AMY, MORPURGO BEN Consistent Production of Mice With Conditional Knockout Alleles by CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing Using Two Guides/Two Oligos Approach, Цитологія і генетика., 2020, том 54, № 1, C. 80-81.

В "Cytology and Genetics". Якщо тільки можливо, цитуйте статтю по нашій англомовній версії:
A. Golovko, J. Adams, Huiping Guo, J. Ballard, A. Gonzales & B. Morpurgo Consistent Production of Mice with Conditional Knockout Alleles by CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing Using Two Guides/Two Oligos Approach, Cytol Genet., 2020, vol. 54, no. 1, pp. 63–70
DOI: 10.3103/S0095452720010065


Посилання

1. Gu, H., Marth, J.D., Orban, P.C., Mossmann, H., and Rajewsky, K., Deletion of a DNA polymerase beta gene segment in T cells using cell type-specific gene targeting, Science, 1994, vol. 265, pp. 103–106.

2. Rajewsky, K., Gu, H., Kuhn, R., Betz, U.A., Muller, W., Roes, J., and Schwenk, F., Conditional gene targeting, J. Clin. Invest., 1996, vol. 98, pp. 600–603.

3. Sauer, B. and Henderson, N., Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1988, vol. 85, pp. 5166–5170.

4. Hoess, R.H. and Abremski, K., Interaction of the bacteriophage P1 recombinase Cre with the recombining site loxP, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1984, vol. 81, pp. 1026–1029.

5. Brand,a, C.S. and Dymecki, S.M., Talking about a revolution: the impact of site-specific recombinases on genetic analyses in mice, Dev. Cell, 2004, vol. 6, pp. 7–28.

6. Jinek, M., et al., A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity, Science, 2012, vol. 337, pp. 816–821.

7. Cho, S.W., Kim, S., Kim, J.M., and Kim, J.S., Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease, Nat. Biotechnol., 2013, vol. 31, pp. 230–232.

8. Cong, L., et al., Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems, Science, 2013, vol. 339, pp. 819–823.

9. Jinek, M., et al., RNA-programmed genome editing in human cells, Elife, 2013, vol. 2. e00471. https://doi.org/10.7554/eLife.00471

10. Mali, P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9, Science, 2013, vol. 339, pp. 823–826.

11. Mashiko, D. et al. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA, Sci. Rep., 2013, vol. 3355, no. 3. https://doi.org/10.1038/srep03355

12. Shen, B. et al. Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated gene targeting, Cell Res., 2013, vol. 23, pp. 720–723.

13. Wang, H. et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering, Cell, 2013, vol. 153, pp. 910–918.

14. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering, Cell, 2013, vol. 154, no. 6, pp. 1370–1379.

15. Gurumurthy, C., et al. Re-evaluating one-step generation of mice carrying conditional alleles by CRISPR-Cas9-mediated genome editing technology, bioRxiv, 2018, vol. 393231. https://doi.org/10.1101/393231

16. Behringer R., et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2014.

17. Horii, T., et al., Efficient generation of conditional knockout mice via sequential introduction of lox sites, Sci Rep., 2017, vol. 7, no. 1, p. 7891.

18. Bishop, K.A., et al., CRISPR/Cas9-mediated insertion of loxP sites in the mouse dock7 gene provides an effective alternative to use of targeted embryonic stem cells, G3 (Bethesda), 2016, vol. 6, no. 7, pp. 2051–2061.

19. Kueh, A.J., et al., An update on using CRISPR/Cas9 in the one-cell stage mouse embryo for generating complex mutant alleles, Cell Death Differ., 2017, vol. 24, no. 10, pp. 1821–1822.

20. Lanza, D.G., et al., Comparative analysis of single-stranded DNA donors to generate conditional null mouse alleles, BMC Biol., 2018, vol. 16, no. 1, p. 69.

21. Pritchard, C.E.J., Kroese, L.J., and Huijbers, I.J., Direct Generation of Conditional Alleles Using CRISPR/ Cas9 in Mouse Zygotes. Methods Mol Biol., 2017, vol. 1642, pp. 21–35.

22. Miyasaka, Y., et al., CLICK: one-step generation of conditional knockout mice, BMC Genomics, 2018, vol. 19, no. 1, p. 318.

Copyright© ICBGE 2002-2021 Coded & Designed by Volodymyr Duplij Modified 24.09.21