РЕЗЮМЕ. Экспрессия генов необходима для понимания мейотического созревания ооцитов коровы и возможностей развития эмбриона. В настоящей работе создан стандартизованный протокол экстракции общей РНК ооцитов и зародышей, который рассматривается как
специфичный и менее затратный. Для этой цели ооциты (n = 795), полученные из примерно 80 яичников, были разделены на три группы: группа 1 протокол с модифицированным тризолом® (MTP, n = 355); группа 2 протокол с гуанидин тиоцианатом (GNTC, n = 140) и группа 3 протокол с коммерческим китом (CKP, n = 60). Ооциты из групп 1 (n = 100) и 3 (n = 20) витрифицированы с помощью двух криопротекторов – 1,2-пропандиола (PROH) или диметилсульфоксида (DMSO). 240 оставшихся ооцитов были разделены на три группы, из которых 100 использованы свежими для оплодотворения in vitro, а 140 витрифицированы с помощью PROH (n = 70) и DMSO (n = 70) как криопротекторов, а после оттаивания оплодотворены in vitro. Зародыши использовали через 9 дней после оплодотворения. Амплификация генов (SDHA, GAPDH and DNMT1) проведена в ооцитах, а количественный анализ экспрессии генов (DNMT1) в полученных in vitro зародышах – на стадии бластоцистов (n ≈ 10). Сравнивалась эффективность экстракции. Чистота образцов в разных протоколах колебалась от 1,10 до 1,25 для GNTC; от 2,05 до 2,63 для CKP; от 1,50 до 2,11 для разработанного MTP. В последнем случае значение показателя приближалось к ожидаемому уровню чистоты образцов РНК (от 1,7 до 2,0). Согласно спектрофотометрическим данным, в среднем для 30 свежих ооцитов концентрация общей РНК составляла 127,8 ± 9,3 нг мкл–1 для MTP, 46,4 ± 9,5 нг мкл–1 для CKP и 47,6 ± 12,9 нг мкл–1 для GNTC. При использовании MTP для оценки РНК в 30 замороженных/оттаявших ооцитах концентрация общей РНК составила 61,3 ± 3,3 и 40,0 ± 12,4 нг мкл–1 соответственно для DMSO и PROH. Что касается концентрации и чистоты общей РНК на стадии бластоцистов, большая чистота наблюдалась при использовании DMSO по сравнению с PROH (1,8 против 1,2) (p < 0,05). Лучшие результаты относительно амплификации генов также наблюдались в случае MTP по сравнению с другими протоколами. Для количественной оценки экспрессии генов предложенный протокол позволил определить экспрессию гена DNMT1 с эффективностью ПЦР (0,933) после нормализации в отношении экспрессии генов GAPDH и SDHA. Амплификация и количественная оценка экспрессии генов доказали специфичность и эффективность MTP в сравнении с другими протоколами.
Ключові слова: total RNA extraction, bovine oocytes and em-bryos, gene amplification and gene quantification
