Ідентифіковано, клоновано і делетовано гени Meyerozyma (Candida, Pichia) guilliermondii, які кодують гомологи транскрипційного фактора Sef1p Candida famata і Tup1p Candida albicans, відповідно. Делеція гомолога транскрипційного фактора Sef1p у M.(P.) guilliermondii повністю блокує надсинтез рибофлавіну за умов дефіциту заліза. Результати комплементаційного аналізу вказують на те, що раніше описані мутанти M.(P.) guilliermondii rib83 і сконструйовані делеційні штами належать до однієї комплементаційної групи і мають дефект у тому ж гені SEF1. Інактивація ідентифікованого гомолога гена TUP1 у штаму дикого типу M.(P.) guilliermondii приводить до зростання вмісту заліза в клітинах в 1,5 раза та підвищення продукції рибофлавіну в 1,6–1,7 раза. Введення плазміди, що несе копію гена TUP1, не відновлює метаболічні дефекти у мутанта, датного до надпродукції рибофлавіну і акумуляції заліза в клітинах мутанта M.(P.) guilliermondii m3, що несе мутацію hit1. Отримані результати дозволяють вважати, що у дріжджів, які належать до клади CUG, і транскрипційний фактор Sef1р, і Tup1p залучені в регуляцію обох процесів: забезпечення залізом і синтез рибофлавіну. Молекулярні механізми дії Tup1p на біосинтез рибофлавіну у M.(P.) guilliermondii потребують подальшого дослідження.
РЕЗЮМЕ. Идентифицированы, клонированы и делетированы гены Meyerozyma (Candida, Pichia) guilliermondii, кодирующие гомологи транскрипционного фактора Sef1p Candida famata и Tup1p Candida albicans, со-ответственно. Делеция гомолога транскрипционного фактора Sef1p у M.(P.) guilliermondii полностью блокирует сверхсинтез рибофлавина в условиях дефицита железа. Результаты комплементационного анализа указывают на то, что ранее описанные мутанты M.(P.) guilliermondii rib83 и сконструированные делеционные штаммы относятся к одной комплементационной группе и дефектны в одном и том же гене SEF1. Инактивация идентифицированного гомолога гена TUP1 у штамма дикого типа M.(P.) guilliermondii приводит к возрастанию содержания железа в клетках в 1,5 раза и повышению продукции рибофлавина в 1,6–1,7 раза. Введение плазмиды, несущей копию гена TUP1, не восстанавливает метаболические дефекты у мутанта, обладающего способностью к сверхсинтезу рибофлавина и аккумуляции железа в клетках мутанта M.(P.) guilliermondii m3, несущего мутацию hit1. Полученные результаты позволяют считать, что у дрожжей, относящихся к кладе CUG, и транскрипционный фактор Sef1р, и Tup1p вовлечены в регуляцию обоих процессов: обеспечение железом и синтез рибофлавина. Молекулярные механизмы действия Tup1p на биосинтез рибофлавина у M.(P.) guilliermondii требуют дальнейшего изучения.
Ключові слова: дріжджі, рибофлавін, асиміляція заліза, транскрипційна регуляція
дрожжи, рибофлавин, ассимиляция железа, транскрипционная регуляция
Повний текст та додаткові матеріали
Цитована література
1. Sibirny, A. and Boretsky, Y., Pichia guilliermondii, in Yeast Biotechnology: Diversity and Applications, Satyanarayana, T. and Kunze, G., Eds., Springer Science, 2009, pp. 113–134. https://doi.org/10.1007/978-1-4020-8292-4_6
2. Zviagil’skaia, R.A., Fedorovich, D.V., and Shavlovskiĭ, G.M., Respiratory system of Pichia guilliermondii yeasts with different levels of flavinogenesis, Mikrobiologiia, 1978, vol. 47, no. 6, pp. 975–984. PMID: 745565
3. Abbas, C.A. and Sibirny, A.A., Genetic control of biosynthesis and transport of riboflavin and flavin nucleotides and construction of robust biotechnological producers, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 2011, vol. 75, no. 2, pp. 321–360. https://doi.org/10.1128/MMBR.00030-10
4. Sibirny, A.A., Fedorovych, D.V., Boretsky, Y.R., and Voronovsky, A.Y., Microbial Synthesis of Flavins, Kyiv: Naukova Dumka, 2006.
5. Fedorovich, D., Protchenko, O., and Lesuisse, E., Iron uptake by the yeast Pichia guilliermondii. Flavinogenesis and reductive iron assimilation are coregulated processes, Biometals, 1999, vol. 12, no. 4, pp. 295–300. https://doi.org/10.1023/a:1009298530145
6. Stenchuk, N.N., Kutsiaba, V.I., Kshanovskaia, B.V., and Fedorovich, D.V., Effect of rib83 mutation on riboflavin biosynthesis and iron assimilation in Pichia guilliermondii,Mikrobiologiia, 2001, vol. 70, no. 6, pp. 753–758. PMID: 11785131
7. Philpott, C.C. and Protchenko, O., Response to iron deprivation in Saccharomyces cerevisiae, Eukaryot. Cell, 2008, vol. 7, no. 1, pp. 20–27. https://doi.org/10.1128/EC.00354-07
8. Dmytruk, K.V., Voronovsky, A.A., and Sibirny, A.A., Insertion mutagenesis of the yeast Candida famata (Debaryomyces hansenii) by random integration of linear DNA fragments, Curr. Genet., 2006, vol. 50, no. 3, pp. 183–191. https://doi.org/10.1007/s00294-006-0083-0
9. Hsu, P.C., Yang, C.Y., and Lan, C.Y., Candida albicans Hap43 is a repressor induced under low-iron conditions and is essential for iron-responsive transcriptional regulation and virulence, Eucaryot. Cell, 2011, vol. 10, no. 5, pp. 207–225. https://doi.org/10.1128/EC.00158-10
10. Linde, J., Wilson, D., Hube, B., and Guthke, R., Regulatory network modelling of iron acquisition by a fungal pathogen in contact with epithelial cells. BMC Syst Biol., 2010, vol. 4, no. 4, pp. 148–162. https://doi.org/10.1186/1752-0509-4-148
11. Chen, C., Pande, K., French, S.D., Tuch, B.B., and Noble, S.M., An iron homeostasis regulatory circuit with reciprocal roles in Candida albicans commensalism and pathogenesis, Cell Host Microbe, 2011, vol. 10, no. 2, pp. 118–135. https://doi.org/10.1016/j.chom.2011.07.005
12. Knight, S., Lesuisse, E., Stearman, R., Klausner, R., and Dancis, A., Reductive iron uptake by Candida albicans: role of copper, iron and TUP1 regulator, Microbiology, 2002, vol. 148, no. 1, pp. 29–40. https://doi.org/10.1099/00221287-148-1-29
13. Murad, A.M., d’Enfert, C., Gaillardin, C., Tournu, H., Tekaia, F., Talibi, D., Marechal, D., Marchais, V., Cottin, J., and Brown, A.J., Transcript profiling in Candida albicans reveals new cellular functions for the transcriptional repressors CaTup1, CaMig1 and CaNrg1, Mol. Microbiol., 2001, vol. 42, no. 4, pp. 981–993. https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.2001.02713.x
14. García-Sánchez, S., Mavor, A., Russell, C., Argimon, S., Dennison, P., Enjalbert, B., and Brown, A., Global roles of Ssn6 in Tup1- and Nrg1-dependent gene regulation in the fungal pathogen, Candida albicans,Mol. Biol. Cell., 2005, vol. 16, no. 6, pp. 2913–2925. https://doi.org/10.1091/mbc.e05-01-0071
15. Tartas, A., Zarkadas, C., Palaiomylitou, M., Gounalaki, N., Tzamarias, D., and Vlass,i, M., Ssn6-Tup1 global transcriptional co-repressor: role of the N-terminal glutamine-rich region of Ssn6, PLoS One, 2017, vol. 12, no. 10. e0186363. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0186363
16. Pynyaha, Y.V., Boretsky, Y.R., Fedorovych, D.V., Fayura, L.R., Levkiv, A.I., Ubiyvovk, V.M., Protchenko, O.V., Philpott, C.C., and Sibirny, A.A., Deficiency in frataxin homologue YFH1 in the yeast Pichia guilliermondii leads to missregulation of iron acquisition and riboflavin biosynthesis and affects sulfate assimilation, Biometals, 2009, vol. 22, no. 6, pp. 1051–1061. https://doi.org/10.1007/s10534-009-9256-x
17. Boretsky, Y.R., Protchenko, O.V., Prokopiv, T.M, Mukalov, I.O., Fedorovych, D.V., and Sibirny, A.A., Mutations affecting regulation of riboflavin synthesis and iron assimilation also cause oxidative stress in the yeast Pichia guilliermondii,J. Basic Microbiol., 2007, vol. 47, no. 5, pp. 371–377. https://doi.org/10.1002/jobm.200610279
18. Sambrook, J. and Russell, D.W., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 2001. ISBN-10 0-87969-577-3.
19. Boretsky, Y.R., Pynyaha, Y.V., Boretsky, V.Y., Kutsyaba, V.I., Protchenko, O.V., Philpott, C.C., and Sibirny, A.A., Development of a transformation system for gene knock-out in the flavinogenic yeast Pichia guilliermondii,J. Microbiol. Methods, 2007, vol. 70, no. 1, pp. 13–19. https://doi.org/10.1016/j.mimet.2007.03.004
20. Shavlovskii, G., Logvinenko, E., and Zakalskii, A., Purification and properties of GTP cyclohydrolase II of the yeast Pichia guilliermondii,Biokhimiya, 1983, vol. 48, no. 5, pp. 837–843. PMID: .6871289
21. Stadler, J.A. and Schweyen, R.J., The Yeast iron regulon is induced upon cobalt stress and crucial for cobalt tolerance, J. Biol. Chem., 2002, vol. 277, no. 42, pp. 39649–39654. https://doi.org/10.1074/jbc.M203924200
22. Lin, X., Yu, A.Q., Zhang, C.Y., Pi, L., Bai, X.-W., and Xiao, D.G., Functional analysis of the global repressor Tup1 for maltose metabolism in Saccharomyces cerevisiae: different roles of the functional domains, Microb. Cell Fact., 2017, vol. 16, no. 1, pp.194–206. https://doi.org/10.1186/s12934-017-0806-6
23. Boretsky, Y.R., Kapustyak, K.Y., Fayura, L.R., Stasyk, O.V., Stenchuk, M.M., Bobak, Y.P., Drobot, L.B., and Sibirny, A.A., Positive selection of mutants defective in transcriptional repression of riboflavin synthesis by iron in the flavinogenic yeast Pichia guilliermondii,FEMS Yeast Res., 2005, vol. 5, no. 9, pp. 829–837. https://doi.org/10.1016/j.femsyr.2005.03.007
24. Fedorovych, D., Boretsky, Y., Prokopiv, T., Grabek-Leiko, D., and Sybirny, A., Cobalt as a dangerous environmental pollutant, in Living Organisms and Bioanalytical Approaches for Detoxification and Monitoring of Toxic Compounds, Sibirny, A., Fedorovych, D., Gonczar, M., and Grabek-Leiko, D., Eds., Rzeszow University, pp. 33–40.
25. Prokopiv, T.M., Fedorovych, D.V., Boretsky, Y.R., and Sibirn,y, A.A., Oversynthesis of riboflavin in the yeast Pichia guilliermondii is accompanied by reduced catalase and superoxide dismutases activities, Curr. Microbiol., 2013, vol. 66, no. 1, pp. 79–87. https://doi.org/10.1007/s00284-012-0242-0
26. Wong, K.H. and Struhl, K., The Cyc8–Tup1 complex inhibits transcription primarily by masking the activation domain of the recruiting protein, Genes Dev., 2011, vol. 25, no. 23, pp. 2525–2539. https://doi.org/10.1101/gad.179275.111.47