Молекулярні технології в детекції чутливих та стійких до ізоніазиду мікобактерій туберкульозу

Розроблено два варіанти детекції однонуклеотидних поліморфізмів у кодоні 315 гена katG мікобактерій туберкульозу (МТБ), мутації в якому асоційовані з резистентністю до ізоніазиду – протитуберкульозного препарату першого ряду. Два набори праймерів, кожний з яких містить додатковий конкурентний блокуючий праймер з 3’­термінальною фосфатною групою (для елімінації неспецифічної ампліфікації), дозволяють у кодоні 315 гена katG виявляти точкові мутації AGC→ACC та AGC→AGA, що найчастіше зустрічаються. Проведення ПЛР з набором із двох праймерів, один з яких містить п’ять LNA­мономерів, дозволяє встановити наявність будь­якого з шести відомих варіантів мутацій у кодоні 315 гена katG, тобто диференціювати чутливі та резистентні до ізоніазиду МТБ. Чистоту та будову праймерів довжиною 17 нуклеотидів, що містять LNA­модифіковані нуклеотиди, охарактеризовано часопролітною мас-спектрометрією з матрично-активованою лазерною десорбцією/іонізацією, а 17­мірний дуплекс, утворений двома комплементарними олігонуклеотидами з LNA­мономерами, – методом термічної денатурації. Створені молекулярно­генетичні тест­системи для виявлення ізолятів дикого типу та резистентних МТБ до протитуберкульозного препарату першого ряду ізоніазиду можуть застосовуватися у клінічних лабораторіях зі стандартним ПЛР­обладнанням та дозволяють скоротити визначення резистентності МТБ до ізоніазиду з 1–3 місяців стандартними бактеріологічними методами до 1–3 днів шляхом ПЛР.

Разработаны два варианта детекции однонуклеотидных полиморфизмов в кодоне 315 гена katG микобактерий туберкулеза (МТБ), мутации в котором ассоциированы с устойчивостью к изониазиду – противотуберкулезному препарату первого ряда. Два набора праймеров, каждый из которых содержит дополнительный конкурентный блокирующий праймер с 3’-терминальной фосфатной группой (для элиминации неспецифической амплификации), позволяют выявлять наличие наиболее часто встречающихся точечных мутаций AGC→ACC и AGC→AGA в кодоне 315 гена katG. Проведение ПЦР с набором из двух праймеров, один из которых содержит пять LNA-мономеров, позволяет определить наличие любого из шести известных вариантов мутаций в кодоне 315 гена katG, т.е. дифференцировать чувствительные и резистентные к изониазиду МТБ. Чистота и строение праймеров длиной 17 нуклеотидов, содержащих LNA-модифицированные нуклеотиды, охарактеризованы времяпролетной массспектрометрией с матричноактивированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF), а 17-мерный дуплекс, образованный двумя комплементарными олигонуклеотидами с LNA-мономерами, – методом термической денатурации.

Ключові слова: точечная мутация, полимеразная цепная реакция, микобактерии туберкулеза, изониазид, LNA-мономер