Шпильковий зонд порівняно з лінійним в умовах проведення ПЛР-РЧ характеризується вищою ефективністю гасіння флуоресценції, що веде до нижчого фонового рівня флуоресценції та, отже, більшого співвідношення сигнал/шум при проведенні ПЛР у реальному часі. Проведено експериментальне порівняння ефективності гасіння флуоресценції двох олігонуклеотидних зондів в різних конформаціях – шпилькового у форматі молекулярного маяка та лінійного у форматі TaqMan. Існує різниця у взаємодії гасника з флуорофором для зондів різної конформації. Для лінійного зонда гасіння відбувається через механізм індуктивно-резонансного переносу енергії (ФРПЕ, або FRET), а для шпилькового зонда – за допомогою контактного гасіння через більш близьке розташування флуорофора та гасника, але можливим є й резонансний перенос енергії за механізмом Ферстера. Показано, що спектр поглинання для лінійного зонда практично збігається зі спектром поглинання олігонуклеотида, який представляє зонд без гасника, що вказує на динамічний (Ферстеровський) механізм переносу енергії. Навпаки, спектри поглинання для шпилькового зонда та олігонуклеотида, який представляє зонд без гасника, значно відрізняються, що свідчить про контактний механізм переносу енергії між флуорофором та гасником флуоресценції. Спектри флуоресценції зондів та їхніх комплексів з олігонуклеотидом, що є комплементарним лінійному зонду (та петлі шпилькового зонда), та ампліконом (довжиною 200 п.н., який містить ДНК-мішень для зондів) дозволили порівняти ці два зонди через порівняння радіусів міграції енергії, ефективності гасіння флуоресценції донора. Розрахований з експериментальних даних радіус міграції енергії R для шпилькового зонда становив 32,4 Å, а для лінійного зонда – 47,3 Å.
Keywords: fluorescence quenching, fluorescent probe, probe characterization, real-time PCR, FRET, oligonucleotide binding, oligonucleotide duplex, fluorescence spectra
Full text and supplemented materials
References
Demchenko, A.P., Introduction in Fluorescence Sensing, Berlin: Springer Science and Business Media, 2009.
Book
Dexter, D.L., A theory of sensitized luminescence in solids, J. Chem. Phys., 1953, vol. 21, pp. 836–850. https://doi.org/10.1063/1.1699044
Forster, T., Zwischenmolekulare energiewanderung und fluoreszenz, Ann. Phys. (Leipzig), 1948, vol. 2, p. 55. https://doi.org/10.1002/andp.19484370105
Hadjinicolaou, A.V., Demetriou, V.L., Hezka, J., et al., Use of molecular beacons and multi-allelic real-time PCR for detection of and discrimination between virulent Bacillus anthracis and other Bacillus isolates, J. Microbiol. Methods, 2009, vol. 78, pp. 45–53. https://doi.org/10.1016/j.mimet.2009.04.005
Howell, W.M., Jobs, I.M., and Brookes, A.J., iFRET: An improved fluorescence system for DNA-melting analysis, Genome Res., 2002, vol. 12, pp. 1401–1407. http://www.genome.org/cgi/doi/10.1101/gr.297202
Hunyadi, S. and Murphy, C., Tunable one-dimensional silver-silica nanopeapod architectures, J. Phys. Chem. B., 2006, vol. 110, pp. 7226–7231. https://doi.org/10.1021/jp0603076
Inokuti, M. and Hirayama, F., Influence of energy transfer by the exchange mechanism on donor luminescence, J. Chem. Phys., 1965, vol. 43, p. 1978. https://doi.org/10.1063/1.1697063
Josefsen, M.H., Löfström, C., Sommer, H.M., et al., Diagnostic PCR: Comparative sensitivity of four probe chemistries, Mol. Cell. Probes, 2009, vol. 23, pp. 201–203. https://doi.org/10.1016/j.mcp.2009.02.03
Kapanidis, A. and Weiss, S., Fluorescent probes and bioconjugation chemistries for single molecule fluorescence analysis of biomolecules, J. Chem. Phys., 2002, vol. 117, pp. 10953–10964. https://doi.org/10.1063/1.1521158
Krasnoperov, L.N., Marras, S.A., Kozlov, M., et al., Luminescent probes for ultrasensitive detection of nucleic acids, Bioconjugate Chem., 2010, vol. 21, pp. 319–327. https://doi.org/10.1021/bc900403n
Lakowicz, J.R., Principles of Fluorescence Spectroscopy, New York: Springer-Verlag, 2007.
Latorra, D., Arar, K., and Hurley, J.M., Design considerations and effects of LNA in PCR primers, Mol. Cell. Probes, 1986, vol. 17, pp. 253–259. https://doi.org/10.1016/s0890-8508(03)00062-8
Le Reste, L., Hohlbein, J., Gryte, K., et al., Characterization of dark quencher chromophores as nonfluorescent acceptors for single-molecule FRET, Biophys. J., 2012, vol. 102, pp. 2658–2668. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2012.04.028
Limanskaya, O.Yu., Murtazaeva, L.Î., and Limanskii, A.P., Species specific detection of causative agent of anthrax, Biotechnology, 2012, vol. 5, no. 1, pp. 92–99.
Ma, C., Liu, H., Wu, K., et al., An exonuclease I-based quencher-free fluorescent method using DNA hairpin probes for rapid detection of microRNA, Sensors, 2017, vol. 17, p. 760. https://doi.org/10.3390/s17040760
Marras, S., Interactive fluorophore and quencher pairs for labeling fluorescent nucleic acid hybridization probes, Mol. Biotechnol., 2008, vol. 38, pp. 247–255. https://doi.org/10.1007/s12033-007-9012-9
Marras, S., Kramer, F., and Tyagi, S., Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes, Nucleic Acids Res., 2002, vol. 30, p. e122. https://doi.org/10.1093/nar/gnf121
Marras, S.A., Kramer, F.R., and Tyagi, S., Genotyping SNPs with molecular beacons, Methods Mol. Biol., 2003, vol. 212, pp. 111–128. https://doi.org/10.1385/1-59259-327-5:111
Miura, M., Tanigawa, C., Fujii, Y., et al., Comparison of six commercially-available DNA polymerases for direct PCR, Rev. Inst. Med. Trop. Sao Paulo, 2013, vol. 55, pp. 401–406. https://doi.org/10.1590/S0036-46652013000600005
Munoz, C., Talquenca, S.G., and Volpe, M.L., Tetra primer ARMS-PCR for identification of SNP in β-tubulin of Botrytis cinerea, responsible of resistance to benzimidazole, J. Microbiol. Methods, 2009, vol. 78, pp. 245–246. https://doi.org/10.1016/j.mimet.2009.06.007
Parsons, B.L., McKinzie, P.B., and Heflich, R.H., Allele-specific competitive blocker-PCR detection of rare base substitution, Methods Mol. Biol., 2005, vol. 291, pp. 235–245. https://doi.org/10.1385/1-59259-840-4:235
Sjoback, R., Nygren, J., and Kubista, M., Absorption and fluorescence properties of fluorescein, Spectrochim. Acta, Part A, 1995, vol. 51, pp. L7–L21.
Takayamaa, I., Nakauchia, M., Takahashia, H., et al., Development of real-time fluorescent reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay with quenching primer for influenza virus and respiratory syncytial virus, J. Virol. Methods, 2019, vol. 267, pp. 53–58. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2019.02.010
Tyagi, S. and Kramer, F.R., Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization, Nat. Biotechnol., 1996, vol. 14, pp. 303–308. https://doi.org/10.1038/nbt0396-303
Vester, B. and Wengel, J., LNA (locked nucleic acid): high-affinity targeting of complementary RNA and DNA, Biochemistry, 2004, vol. 43, pp. 13233–13241. https://doi.org/10.1021/bi0485732
Wang, R.-H., Liu, L.-M., Zhao, J.-L., et al., A new method for SNP typing based on allele specific PCR, Fa Yi Xue Za Zhi, 2008, vol. 24, pp. 189–193.
Wu, D.Y., Ugozzoli, L., Pal, B.K., and Wallace, R.B., Allele-specific enzymatic amplification of β-globin genomic DNA for diagnosis of sickle cell anemia, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1989, vol. 86, pp. 2757–2760. https://doi.org/10.1073/pnas.86.8.2757
Yaku, H., Yukimasa, T., Nakano, S., et al., Design of allele-specific primers and detection of the human ABO genotyping to avoid the pseudopositive problems, Electrophoresis, 2008, vol. 29, pp. 4130–4140. https://doi.org/10.1002/elps.200800097
Zimmers, Z.A., Adam, N.M., Gabella, W.E., et al., Fluorophore-quencher interactions effect on hybridization characteristics of complementary oligonucleotides, Anal. Methods, 2019, vol. 11, pp. 2862–2867. https://doi.org/10.1039/c9ay00584f
Zuker, M., Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction, Nucl. Acids Res., 2003, vol. 31, pp. 3406–3415. https://doi.org/10.1093/nar/gkg595