Цитологія і генетика 2020, том 54, № 5, 21-26
Cytology and Genetics 2020, том 54, № 5, 393–397, doi: https://www.doi.org/10.3103/S0095452720050047

Деградація ферментів катаболізму метанолу формальдегіддегідрогенази та форміатдегідрогенази у метилотрофних дріжджів Komagataella phaffii

Дмитрук О.В., Булботка Н.В., Сибірний A.A.

  1. Відділ молекулярної генетики і біотехнології, Інститут біології клітини НАН України, Львів, 79005, вул. Драгоманова 14/16
  2. Відділення біотехнології і мікробіології, Жешівський університет, вул. Зельверовича 4, Жешів 35­601, Польща

З’ясування механізмів деградації цитозольних білків має велике фундаментальне та прикладне значення. Досліджено зміни в активності цитозольних ферментів катаболізму метанолу – формальдегіддегідрогенази (Fldh1) та форміатдегідрогенази (Fdh1) у контрольного штаму дикого типу GS200, штаму з делецією гена сенсора гексоз GSS1 та штаму з дефектом автофагії SMD1163 K. phaffii при короткотривалій та довготривалій індукції метанолом з додаванням або ж без додавання інгібітора протеасомної деградації MG132. Показано, що тривалість інкубації клітин на метанолі не має особливого впливу на інактивацію ферменту. Ефект протеасомного інгібітора MG132 був незначний. Катаболітна інактивація цитозольних і пероксисомних ферментів пошкоджена в gss1∆ мутанта, оскільки пошкоджене сигналювання глюкозою. Fldh1 та Fdh1 ймовірно деградують вакуолярним шляхом, незалежно від тривалості індукції метанолом.

РЕЗЮМЕ. Выяснение механизмов деградации цитозольных белков имеет большое фундаментальное и прикладное значение. Исследованы изменения в активности цитозольных ферментов катаболизма метанола – формальдегид дегидрогеназы (Fldh1) и формиат дегидрогеназы (Fdh1) у контрольного штамма дикого типа GS200, штамма с делецией гена сенсора гексоз GSS1 и штамма с дефектом автофагии SMD1163 K. phaffii при кратковременной и долговременной индукции метанолом с добавлением или же без добавления добавлением ингибитора протеасомной деградации MG132. Показано, что продолжительность инкубации клеток в метаноле не имеет особого влияния на инактивацию фермента. Эффект протеасомного ингибитора MG132 был незначителен. Катаболитная инактивация цитозольных и пероксисомных ферментов повреждена у gss1Δ мутанта, поскольку повреждено сигнализирование глюкозой. Fldh1 и Fdh1 вероятно деградируют вакуолярным путем, независимо от продолжительности индукции метанолом.

Ключові слова: формальдегіддегідрогеназа, форміатдегідрогеназа, питома активність, деградація, вакуолі, дріжджі
формальдегид дегидрогеназа, формиатдегидрогеназа, удельная активность, деградация, вакуоли, дрожжи

Цитологія і генетика
2020, том 54, № 5, 21-26

Current Issue
Cytology and Genetics
2020, том 54, № 5, 393–397,
doi: 10.3103/S0095452720050047

Повний текст та додаткові матеріали

Цитована література

1. Gellissen G. Hansenula polymorpha: Biology and Applications, Gellissen, G., Ed., Wiley, 2002.

2. Krasovska, O.S., Stasyk, O.G., Nahorny, V.O., Stasyk, O.V., Granovski, N., Kordium, V.A., Vozianov, O.F., and Sibirny, A.A., Glucose-induced production of recombinant proteins in Hansenula polymorpha mutants deficient in catabolite repression, Biotechnol. Bioeng., 2007, vol. 97, pp. 858–870. https://doi.org/10.1002/bit.21284

3. Grabek-Lejko, D., Sibirny, V., and Sibirny, A., Regulation of gene expression in methylotrophic yeasts, Postepy Biochemii, 2013, vol. 59, pp. 95–106.

4. Macauley-Patrick, S., Fazenda, M.L., McNeil, B., and Harvey, L.M., Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system, Yeast, 2005, vol. 22, no. 4, pp. 249–270. https://doi.org/10.1002/yea.1208

5. Sibirny, A.A., Yeast peroxisomes: structure, functions and biotechnological opportunities, FEMS Yeast Res., 2016, vol. 16, nos. 3–4. https://doi.org/10.1093/femsyr/fow038

6. Nazarko, V.Y., Futej, K.O., Thevelein, J.M., and Sibirny, A.A., Differences in glucose sensing and signaling for pexophagy between the baker’s yeast Saccharomyces cerevisiae and the methylotrophic yeast Pichia pastoris,Autophagy, 2008, vol. 4, pp. 381–384. https://doi.org/10.4161/auto.5634

7. Klionsky, D.J., Cregg, J.M., Dun,n, W.A., Jr., Emr, S.D., Sakai, Y., Sandoval, I.V., Sibirny, A., Subramani, S., Thumm, M., Veenhuis, M., and Ohsumi, Y.A., Unified nomenclature for yeast autophagy-related genes, Dev. Cell, 2003, vol. 5, nos. 3–4, pp. 539–545, https://doi.org/10.1016/s1534-5807(03)00296-x

8. Stasyk, O.V., Nazarko, T.Y., and Sibirny, A.A., Methods of plate pexophagy monitoring and positive selection for ATG gene cloning in yeasts, Methods Enzymol., 2008, vol. 451, pp. 229–239.

9. Stasyk, O.V., Stasyk, O.G., Komduur, J., Veenhuis, M., Cregg, J.M., and Sibirny, A.A., A hexose transporter homologue controls glucose repression in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha,J. Biol. Chem., 2004, vol. 279, pp. 8116–8125. https://doi.org/10.1074/jbc.M310960200

10. Stasyk, O.V., Stasyk, O.G., Mathewson, R.D., Farré, J.-C., Nazarko, V.Y., Krasovska, O.S., Subramani, S., Cregg, J.M., and Sibirny, A.A., Atg28, a novel coiled-coil protein involved in autophagic degradation of peroxisomes in the methylotrophic yeast Pichia pastoris,Autophagy, 2006, vol. 2, pp. 30–38.

11. Nazarko, V.Y., Nazarko, T.Y., Farre, J.C., Stasyk, O.V., Warnecke, D., Ulaszewski, S., Cregg, J.M., Sibirny, A.A., and Subramani, S., Atg35, a micropexophagy-specific protein that regulates micropexophagic apparatus formation in Pichia pastoris,Autophagy, 2011, vol. 7, pp. 1–11. https://doi.org/10.4161/auto.7.4.14369

12. Polupanov, A.S., Nazarko, V.Y., and Sibirny, A.A., CCZ1, MON1 and YPT7 genes are involved in pexophagy, the Cvt pathway and non-specific macroautophagy in the methylotrophic yeast Pichia pastoris,Cell Biol. Int., 2011, vol. 35, no. 4, pp. 311–319. https://doi.org/10.1042/CBI20100547

13. Polupanov, A.S., Nazarko, V.Y., and Sibirny, A.A., Gss1 protein of the methylotrophic yeast Pichia pastoris is involved in glucose sensing, pexophagy and catabolite repression, Int. J. Biochem. Cell Biol., 2012, vol. 44, no. 11, pp. 1906–1918. https://doi.org/10.1016/j.biocel.2012.07.017

14. Polupanov, A.S. and Sibirny, A.A., Cytoplasmic extension peptide of Pichia pastoris glucose sensor Gss1 is not compulsory for glucose signaling, Cell Biol. Int., 2014, vol. 38, no. 2, pp. 172–178. https://doi.org/10.1002/cbin.10189

15. Hung, G.C., Brown, C.R., Wolfe, A.B., Liuand, J., and Chiang, H.L., Degradation of the gluconeogenic enzymes fructose-1,6-bisphosphatase and malate dehydrogenase is mediated by distinct proteolytic path-ways and signaling events, J. Biol. Chem., 2004, vol. 279, pp. 49138–49150. https://doi.org/10.1074/jbc.M404544200

16. Brown, C.R., Wolfe, A.B., and Chiang, H.L., The vacuolar import and degradation pathway merges with the endocytic pathway to deliver fructose-1,6-bisphosphatase to the vacuole for degradation, J. Biol. Chem., 2008, vol. 283, pp. 26116–26127. https://doi.org/10.1074/jbc.M709922200

17. Menssen, R., Schweiggert, J., Schreiner, J., Kusevic, D., Reuther, J., Braun, B., and Wolf, D.H., Exploring the topology of the Gid complex, the E3 ubiquitin ligase involved in catabolite-induced degradation of gluconeogenic enzyme, J. Biol. Chem., 2012, vol. 287, pp. 25602–25614. https://doi.org/10.1074/jbc.M112.363762

18. Giardina, B.J. and Chiang, H.L., Fructose-1,6-bisphosphatase malate dehydrogenase, isocitrate lyase, phosphoenolpyruvate carboxykinase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, and cyclophilin a are secreted in Saccharomyces cerevisiae grown in low glucose, Commun. Integr. Biol., 2013, vol. 6, p. 27216. https://doi.org/10.4161/cib.27216

19. Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., and Randal, R.J., Protein measurement with the Folin phenol reagent, J. Biol. Chem., 1951, vol. 193, pp. 265–275.

20. Tuttle, D.L. and Dunn, A.J., Divergent modes of autophagy in the methylotrophic yeast Pichia pastoris,J. Cell. Sci., 1995, vol. 108, pp. 25–35.