Для исследования структурно-динамических и функциональных свойств N-концевого каталитического модуля тирозил-тРНК синтетазы Bos taurus (мини BtTyrRS) методами флуоресцентной спектроскопии проведен сайт-направленный мутагенез белка по модифицированному методу QuikChang с заменой трех остатков Trp на Ala в его структуре. В процессе последовательных реакций ПЦР с использованием разработанных праймеров получены точечные замены кодонов триптофана TGG на кодоны аланина GCG в нуклеотидной последовательности кДНК каталитического модуля тирозил-тРНК синтетазы, клонированной в экспрессирующей плазмиде pET-30a. В результате получены кДНК мини BtTyrRS, в последовательности которых имеется лишь один кодон триптофана в каждом из трех положений в структуре белка.
РЕЗЮМЕ. Для дослідження структурно-динамічних і функціональних властивостей N-кінцевого каталітичного модуля тирозил-тРНК синтетази Bos taurus (міні BtTyrRS) методами флуоресцентної спектроскопії проведено сайт-спрямований мутагенез білка за модифікованим методом QuikChang з заміною трьох залишків Trp на Ala в його структурі. В процесі послідовних реакцій ПЛР з використанням розроблених праймерів отримані точкові заміни кодонів триптофана TGG на кодони аланіна GCG в нуклеотидній послідовності кДНК каталітичного модуля тирозил-тРНК синтетази, клонованої в експресуючій плазміді pET-30a. В результаті отримані кДНК міні BtTyrRS, в послідовності яких є лише один кодон триптофану в кожному з трьох положень в структурі білк.
Ключові слова: каталитический модуль тирозил-тРНК синтетазы, сайт-направленный мутагенез, кДНК, ПЦР амплификация, ДНК полимераза
каталітичний модуль тирозил-тРНК синтетази, сайт-спрямований мутагенез, кДНК, ПЛР ампліфікація, ДНК полімераза
Повний текст та додаткові матеріали
У вільному доступі: PDFЦитована література
1. Pang, Y.L.J., Poruri, K., and Martinis, S.A., tRNA synthetase: tRNA aminoacylation and beyond, WIREs RNA, 2014, vol. 5, no. 4, pp. 461–480. https://doi.org/10.1002/wrna.1224
2. Kornelyuk, A.I., Structural and functional investigation of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase, Biopolym. Cell, 1998, vol. 14, no. 4, pp. 349–359. https://doi.org/10.7124/bc.0004DF
3. Gnatenko, D.V., Kornelyuk, A.I., Kurochkin, I.V., Ribkinska, T.A., and Matsuka, G.Kh., Isolation and characteristics of functionally active proteolytically modified form of tyrosyl-tRNA synthetase from the bovine liver, Ukr. Biochim. J., 1991, vol. 63, no. 4, pp. 61–67.
4. Greenberg, Y., King, M., Kiosses, W.B., Ewalt, K., Yang, X., Schimmel, P., Reader, J.S., and Tzima, E., The novel fragment of tyrosyl-tRNA synthetase, mini-TyrRS, is secreted to induce an angiogenic response in endothelial cells, FASEB J., 2008, vol. 22, no. 5, pp. 1597–1605. https://doi.org/10.1096/fj.07-9973com
5. Kornelyuk, A.I., Maarten, P.R., Dubrovsky, A.L., and Murray, J.C., Cytokine activity of the non-catalytic EMAP-2-like domain of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase, Biopolym. Cell, 1999, vol. 15, no. 2, pp. 168–172. https://doi.org/10.7124/bc.000516
6. Guo, M. and Schimmel, P., Essential non-translational functions of tRNA synthetases, Nat. Chem. Biol., 2013, vol. 9, pp. 145–153. https://doi.org/10.1038/nchembio.1158
7. Ladokhin, A.S., Fluorescence spectroscopy in peptide and protein analysis, in Meyers, R.A., Ed., Chichester: John Wiley and Sons Ltd., 2002, pp. 5762–5779.
8. Chatttopadhyay, A. and Haldar, S., Dynamic insight into protein structure utilizing red edge excitation shift, Acc. Chem. Res., 2013, vol. 47, no. 1, pp. 12–19. https://doi.org/10.1021/ar400006z
9. Rochamare, S.B. and Gaikwad, M., Tryptophan environment and functional characterization of a kinetically stable serine protease containing a polyproline II fold, J. Fluoresc., 2014, vol. 24, pp. 1363–1370. https://doi.org/10.1007/s10895-014-1445-5
10. Kordysh, M. and Kornelyuk, A., Conformational flexibility of cytokine-like C-module of tyrosyl-tRNA synthetase monitored by Trp144 intrinsic fluorescence, J. Fluoresc., 2006, vol. 16, pp. 705–711. https://doi.org/10.1007/s10895-006-0113-9
11. Turoverov, K.K. and Kuznetsova, I.M., The intrinsic fluorescence of globular actin: peculiarities in the location of tryptophan residues, Bioorg. Chem., 1998, vol. 24, no. 12, pp. 893–898.
12. Vallee-Belisle, A. and Michnick, S.W., Visualizing transient protein-folding intermediates by tryptophan-scanning mutagenesis, Nat. Struct. Mol. Biol., 2012, vol. 19, no. 7, pp. 731–737. https://doi.org/10.1038/nsmb.2322
13. Kordysh, M.A. and Kornelyuk, A.I., Monitoring of the conformational change in the environment of the Trp144 fluorophore in the C-module of tyrosyltRNA synthetase during thermal denaturation, Dop. Nac. Acad. Nauk Ukraine, 2004, no. 1, pp. 156–161.
14. Kordysh, M.A. and Kornelyuk, A.I., Investigation of the interaction between isolated C-module of tyrosyl-tRNA synthetase and tRNA by fluorescence spectroscopy, Biopolym. Cell, 2006, vol. 22, no. 4, pp. 283–298. https://doi.org/10.7124/bc.00073B
15. Klimenko, I.V., Gushcha, T.O., and Kornelyuk, A.I., Properties of tryptophan fluorescence of two forms of tyrosyl-tRNA synthetase from the liver, Biopolym. Cell, 1991, vol. 7, no. 6, pp. 83–88. https://doi.org/10.7124/bc.000303
16. Kornelyuk, A.I., Klimenko, I.V., and Odynets, K.A., Conformational change of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase induced by tyrosyladenylate formation, Biochem. Mol. Biol. Int., 1995, vol. 35, no. 2, pp. 317–322.
17. Kordysh M.O., Kyryushko G.V., Mely, Y., and Kornelyuk O.I. Conformational mobility investigation of TyrRS N-module and its complex with tRNA using the methods of time-resolved fluorescence spectroscopy, Biopolym. Cell, 2007, vol. 23, no. 2, pp. 130–136. https://doi.org/10.7124/bc.00075F
18. Ling, M.M. and Robinson, B.H., Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal. Biochem., 1997, vol. 254, pp. 157–178. https://doi.org/10.1006/abio.1997.2428
19. Inoue, H., Nojima, H., and Okayama, H., High efficiency transformation of Escherichia coli plasmids, Gene, 1990, vol. 96, pp. 23–28. https://doi.org/10.1016/0378-1119(90)90336-P
20. Miller, E.M. and Nickoloff, J.A., Escherichia coli electrotransformation, Methods Mol. Biol., 1995, vol. 47, pp. 105–113. https://doi.org/10.1385/0-89603-310-4:105
21. Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
22. Morrison, K.L. and Weiss, G.A., Combinatorial alanine scanning, Curr. Opin. Chem. Biol., 2001, vol. 5, pp. 302–307. https://doi.org/10.1016/S1367-5931(00)00206-4
23. Liu, H. and Naismith, J.H., An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol, BMC Biotechnol., 2008, vol. 8, no. 1. https://doi.org/10.1186/1472-6750-8-91
24. Vovis, G.F. and Lacks, S., Complementary action of restriction enzymes endo R-DpnI and endo R-DpnII on bacteriophage fI DNA, J. Mol. Biol., 1977, vol. 115, no. 3, pp. 525–538. doi.org/ (77)90169-3 https://doi.org/10.1016/0022-2836
25. Edelheit, O., Hanukoglu, A., and Hanukoglu, I., Simple and efficient site-directed mutagenesis using two single-primer reaction in parallel to generate mutants for protein structure-function studies, BMC Biotechnol., 2009, vol. 9, no. 1. https://doi.org/10.1186/1472-6750-9-61
26. Qui, D. and Scholthof, R.-B.G., A one-step PCR-based method for rapid and efficient site-directed fragment deletion, insertion, and substitution mutagenesis, J. Virol. Methods, 2008, vol. 149, no. 1, pp. 85–90.
27. Salerno, J.C., Jones, R.J., and Erdogan, E., A single-stage polymerase-based protocol for the introduction of deletions and insertion without subcloning, Mol. Biotechnol., 2005, vol. 29, no. 3, pp. 225–232.
28. Tregan, A., Kielbus, M., Czapinski, J., Stepulak, A., Huhtaniemi, I., and Rivero-Muller, A., REPLACR-mutagenesis, a one-step method for site-directed mutagenesis by recombineering, Sci. Rep., 2016, vol. 6. https://doi.org/10.1038/srep19121
29. Tseng, W.-Chi., Lin, J.-W., Wei, T.-Yu., and Fang, T.-Yu., A novel megaprimed and ligase-free, PCR-based, site-directed mutagenesis method, Anal. Biochem., 2008, vol. 375, no. 2, pp. 376–378.
30. Zheng, L., Bauman, U., and Reymnd, J.-L., An efficient one-step site-directed and site-saturation mutagenesis protocol, Nucleic Acids Res., 2004, vol. 32, no. 14. e115. https://doi.org/10.1093/nar/gnh110
31. Blocquel, D., Li Sh, Wei N., Daub H., Sajish M., Erfurth M.-L., Kooi G., Zhou J., Bai G., Schimmel P., Jordanova A., and Yang X.-L. Alternative stable conformation capable of protein misinteraction links tRNA synthetase to peripheral neuropathy, Nucleic Acids Res., 2017, vol. 45, no. 13, pp. 8091–8104. https://doi.org/10.1093/nar/gkx455